St. Nikolai wurde als Vorstadtkirche seit etwa 1314 errichtet. Präsent ist der Kirchenpatron, der hl. Nikolaus, durch eine Reihe von Bildzeugnissen. Besonders die um 1500 geschaffene spätgotische Figur des Heiligen im Innenraum der Kirche ist von hohem Rang. Sie blieb erhalten, obwohl St. Nikolai ein Zentrum der radikalen frühreformatorischen Bewegung in Mühlhausen war. 1523 wählte sich hier zum ersten Mal eine Gemeinde der Stadt mit Heinrich Pfeiffer einen eigenen evangelischen Pfarrer. Der gotische Bau blieb im Mittelalter in einigen Teilen unfertig und wurde schließlich 1897/98 mit einer Vorhalle im Westen und einem neuartigen Deckengewölbe vollendet.